English Title: Studies on alcohol – mediated liver damage: The role of lipopolysaccharides (LPS) in vivo and transforming-growth-factor-β (TGF-β) in vitro

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Abstract

Chronischer Alkoholmissbrauch führt häufig zur Fibrose der Leber, die bei andauernder Schädigung zu einer Zirrhose und schließlich zum Hepatozellulären Karzinom (HCC) führen kann. Um den alkoholbedingten Leberschaden zu untersuchen wurde in vivo die Rolle von LPS in Mäusen mit vorgeschädigter Leber (MDR – 2 KO) und in vitro die Rolle von TGF-β auf primäre Maushepatozyten in Kultur, erforscht. In Alkohol-Dampfkammern wurden MDR – 2 knock out Mäuse (negativ für den Gallensäuretransporter MDR – 2) mit den entsprechenden Kontrollstämmen (Balb-c) 8 Wochen lang jeweils 5 Stunden täglich mit Alkohol bedampft. Da mit dieser Methode die Darmpassage des Alkohols und damit die erhöhte Endotoxinproduktion ausbleibt, wurde eine Gruppe MDR 2 KO- und Kontrolltiere mit LPS (Lipopolysaccharid/ i.p Injektion) und Alkohol behandelt. Die resultierenden Serumwerte für ALT und AST zeigten keine signifikanten Veränderungen nach LPS – Injektion oder Alkoholbedampfung. Die ALP Aktivität stieg jedoch nach Alkoholexposition bei den gesunden Tieren an. In den vorgeschädigten Lebern der MDR – 2 KO Mäusen führte LPS alleine, Alkohol alleine und die Kombination der beiden Substanzen, mit einigen Schwankungen zu erhöhten Serumwerten. Eine Hepatomegalie bekamen die MDR 2 KO Mäuse, die mit Alkohol und bei den Wildtyp Mäusen diejenigen, die mit Alkohol und LPS behandelt wurden. Nach quantitativer Auswertung von Sirius Rot Färbungen aller Mäuse im Versuch wurde sowohl bei den Wildtyp- als auch bei den MDR 2 KO – Tieren durch LPS Gabe eine leichte Erhöhung der Kollagenablagerung in der Leber beobachtet, die bereits durch Alkohol alleine verstärkt wurde und sich bei den Wildtypen durch beide Substanzen zusammen erhöhte. Bei den MDR 2 KO Mäusen mit Alkohol zeigte die zusätzliche LPS-Gabe keine weitere Erhöhung. Zusätzlich wurde beobachtet, dass die Kollagenablagerung bei den Wildtyptieren perisinusoidal und perizentral auftrat, wobei sie bei den MDR 2 KO Mäusen eher periportal zu sehen war. Somit konnte in vivo die Rolle von LPS und Ethanol getrennt voneinander und die Wirkung von beiden Substanzen zusammen untersucht werden. Bei einer leichten Vorschädigung der Leber erhöhte sich der Schaden durch beide Substanzen zusammen, wobei weder der Alkohol noch LPS alleine zu einem deutlichen Schaden führte. Das pro-fibrogene Zytokin TGF-β ist im Serum von Patienten mit alkoholischer Lebererkrankung stark erhöht und die TGF-β Signalwege sind in fibrotischen Arealen der Lebern solcher Patienten verstärkt aktiv. Ethanol und TGF-β zeigten in vitro auf primäre Maushepatozyten einen Dosis-abhängigen zytotoxischen Effekt, wobei durch beide Substanzen zusammen die Zellen durch Aktivierung von Caspase 3 und Ausschüttung von Cytochrom C aus den Mitochondrien, in Apoptose gingen. Ethanol reduzierte die basale Aktivität von Akt, induzierte den TGF-β Rezeptor II und PTEN. Nach Inhibierung des TGF-β Rezeptor I durch SB431542 wurde auch die Caspase 3 Aktivität reduziert, was auf eine Smad-abhängige Apoptose-Induktion hindeutet. Die Hemmung der PI3K Aktivität durch LY294002 verstärkte die Apoptose wobei die Inhibierung von GSK3 sie verminderte. Antiapoptotisches Bcl2 wurde durch Ethanol herunterreguliert was offenbar zur pro-apoptotischen Wirkung von TGF-β beitrug. Zusammenfassend induzierte TGF-β in vitro zunächst „survival“-Signalwege, in Kombination mit Alkohol wurde jedoch verstärkt der programmierte Zelltod eingeleitet. Weder Ethanol noch TGF-β alleine führte die Zellen in Apoptose, was mit den in vivo Ergebnissen korreliert, dass Alkohol alleine unter „gesunden“ Grundbedingungen und in begrenzten Mengen meistens zu keinem massiven Schaden führt, dass Alkohol aber in Kombination mit mindestens einer weiteren schädigenden Noxe deutlich mehr Zelltod und somit Organschaden bewirkt.

Translation of abstract (English)

Chronic alcohol abuse often leads to liver fibrosis, which can accelerate to cirrhosis and finally to hepatocellular carcinoma (HCC). To investigate the alcohol-mediated liver damage, were analyzed the role of LPS in mice with predamaged liver (MDR - 2 KO's) in vivo and the role of TGF-β on primary mouse hepatocytes in culture in vitro. MDR - 2 knock out mice (negative for the bile acid transporter MDR - 2) and the corresponding wildtype mice (Balb-c) were intoxicated with alcohol in alcohol vapor chambers, 5 hours per day for 8 weeks. Since this method avoided the intestinal passage and thereby leakage of bacterial endotoxin LPS (Lipopolysaccharid) from the gut into the blood stream, some animals of both groups were additionally treated with LPS (i.p. injections). The results showed that in healthy animals serum levels of liver damage (ALT, AST, ALP) are not significantly changed by any of the treatments except for moderately increased levels of ALP caused by ethanol alone. In the pre-damaged livers of MDR - 2 KO mice, LPS alone, alcohol alone and the combination of the two substances together, led with some fluctuations, to increased serum levels in these animals. A hepatomegaly was observed in MDR - 2 KO mice which were treated with alcohol and wildtype mice which were treated with alcohol and LPS. Quantitative analyses of Sirius red stainings showed a mild increase of fibrotic areas in all groups (wildtype - and MDR 2 knockout mice) after treatment with LPS, which was also elevated by ethanol alone and reached a higher level with both substances together in wildtype animals. In the MDR 2 KO mice with alcohol the additional LPS administration showed no further increase. In addition, it was observed that the collagen deposition in wildtype mice occurred perisinusoidal and pericentral, whereas in MDR 2 knockout mice it was observed rather in periportal areas. Thus, the role of LPS and ethanol separately and the effect of the two substances togehther was examined in vivo. With some pre-damage of the liver (increasing cholestasis on the KO mice), both substances together led to higher damage, which couldn´t be achieved neither by alcohol nor by LPS alone. The pro-fibrogenic cytokine TGF-β is elevated in the serum of patients with alcoholic liver disease and the TGF-β signaling pathway is activated in fibrotic areas of the livers in these patients. Ethanol and TGF-β showed in vitro a dose-dependent cytotoxic effect on primary mouse hepatocytes, while both substances together led to massive apoptosis as documented by activation of caspase 3 and cytochrome c release from the mitochondria. Ethanol reduced the basal activity of Akt and induced expression of the TGF-β receptor II and PTEN.After inhibition of TGF-β receptor I by SB431542 the caspase 3 activity was also inhibited, which suggested a Smad-dependent mechanism of apoptosis induction. Inhibition of PI3K activity by LY294002 increased apoptosis and inhibition of GSK3 reduced it. Anti-apoptotic Bcl 2 was downregulated by ethanol possibly supporting the pro-apoptotic effect of TGF-β. In summary, TGF-β first induced "survival" pathways but with pre-damage due to alcohol its effects witched to induction of programmed cell death. Neither ethanol nor TGF-β alone caused strong apoptosis, which correlates with the in vivo results that alcohol alone under otherwise "healthy" conditions and within a certain dosage does not lead to massive damage. In combination with at least one additional noxe the effects of alcohol are significantly enhanced in vivo as well as in vitro.