Preview

PDF, English Download (3MB) | Terms of use

Abstract

In the cytoplasm of a eukaryotic cell, the mRNAs are stored, translated and degraded. The balance between these processes is believed to be determined by multiple interactions between the mRNA and various RNA binding proteins. These interactions in turn are influenced by the gene regulation in response to various changes in the cellular environment. In T. brucei, the regulation of gene expression operates at the posttranscriptional level. ZC3H11, a CCCH zinc finger protein in T. brucei is known to specifically bind and stabilize the heat shock mRNAs. Through affinity purification, ZC3H11 was found to interact with MKT1 and PBP1. These proteins caught our interest, as their orthologues are known to exist and interact in yeast. Also, Ataxin-2, the orthologue of PBP1 in mammals is covered in various other studies, owing to its medical relevance. Furthermore, in both yeast and mammals, PBP1 was shown to interact with Poly (A) binding protein (PABP). During my PhD, I tried to decipher the role of MKT1 and PBP1 in T.brucei. I verified the interaction of both these proteins and found them to be essential for survival of bloodstream form of T.brucei. Through an extensive yeast two-hybrid analysis, I could show that both PBP1 and MKT1 are necessary for the function of ZC3H11; and PBP1 also interacts with Poly (A) binding protein (PABP). Thus, through my study, I propose a mechanism for action of ZC3H11 where it stabilizes its target chaperone-encoding mRNA by recruiting MKT1-PBP1 complex, which in turns interacts with PABP. The PABP then facilitates mRNA circularization by tethering the 3’ end with the 5’cap through its interaction with eIF4E. Additionally, through interaction partner search by MKT1 yeast two-hybrid library screen, it was found that MKT1 binds to a fair number of RNA binding proteins, some of which also contain a conserved HNPY motif towards their C-terminus. I then validated the importance of this motif in ZC3H11 function and also showed that its presence is sufficient for interaction of MKT1 with CFB1D (another interacting partner of MKT1, identified in the screen). I anticipate that the finding and mechanism proposed for ZC3H11 function, through this study, could perhaps be applicable to other RNA binding proteins, which interact with MKT1.Moreover, I could also show that just like in yeast, MKT1 and PBP1 both co-associate with the translating polyribosomes and PBP1 also relocates to stress granules after nutrient starvation. This is consistent with both these proteins playing roles in transcript regulation following cellular stress. Overall, through this study I suggest that trypanosome MKT1 acts as a ‘hub’ assisting in posttranscriptional regulation of various transcripts. I propose that MKT1 confers this role by binding directly or indirectly to a variety of RNA binding proteins thereby upgrading the ‘one transcript-one regulator’ models for gene regulation.

Translation of abstract (German)

mRNA wird im Zytoplasma eukaryotischer Zellen gelagert, translatiert und abgebaut. Das Gleichgewicht dieser Prozesse wird vermutlich über viele Interaktionen zwischen mRNA und verschiedenen RNA-Bindeproteinen (RBP) bestimmt. Diese Interaktionen wiederum werden von der Genregulation als Antwort auf verschiedene Änderungen in der zellulären Umgebung beeinflusst. In T. brucei wirkt die Regulation der Genexpression auf der post-transkriptionalen Ebene. Es ist bekannt, dass ZC3H11, ein CCCH Zinkfingerprotein in T. brucei, spezifisch Hitzeschockprotein kodierende mRNAs bindet und stabilisiert. Mittels Affinitätsaufreinigung wurde entdeckt, dass ZC3H11 mit MKT1 und PBP1 interagiert. Diese Proteine sind von Interesse, da ihre Orthologe in Hefe existieren und interagieren. Außerdem wurde Ataxin-2, das PBP1 Ortholog in Säugerzellen, aufgrund seiner medizinischen Relevanz in verschiedenen Studien untersucht. In Hefe und Säugerzellen wurde auch gezeigt, dass PBP1 mit PolyA-Bindeprotein (PABP) interagiert. In meiner Doktorarbeit versuchte ich die Rollen von MKT1 und PBP1 in T. brucei zu entschlüsseln. Ich verifizierte die Interaktion dieser Proteine und fand, dass sie essentiell für die Blutstromform von T. brucei sind. Mit Hilfe einer detaillierten Hefe-Zwei-Hybrid (Y2H) Analyse konnte ich zeigen, dass sowohl PBP1 als auch MKT1 für die Funktion von ZC3H11 notwendig sind; außerdem interagiert PBP1 mit PABP in T. brucei. Durch diese Studie schlage ich daher einen Mechanismus der Wirkungsweise von ZC3H11 vor, in dem ZC3H11 seine Ziel-Hitzeschock mRNAs stabilisiert, indem es den MKT1-PBP1 Komplex rekrutiert, der seinerseits mit PABP interagiert. PABP erleichtert dann die Zirkularisierung der mRNA mittels Bindung des 3’ Endes mit der 5’ Kappe über die Interaktion mit eIF4E. Außerdem wurde bei einer Interaktionspartnersuche für MKT1 mittels Y2H gefunden, dass MKT1 mit zahlreichen RBPs interagiert, von denen einige auch ein konserviertes HNPY Motif in Richtung des C-Terminus hatten. Danach validierte ich die Bedeutung dieses Motifs für die Aktivität von ZC3H11 und zeigte außerdem, dass seine Anwesenheit für die Interaktion von MKT1 mit CFB1D (ein weiterer Interaktionspartner von MKT1) ausreichend ist. Ich erwarte dass dieser Fund und der in dieser Studie vorgeschlagene Mechanismus für die Aktivität von ZC3H11, vielleicht auf andere RBPs die mit MKT1 interagieren übertragbar ist. Desweiteren konnte ich zeigen, dass MKT1 und PBP1 wie in Hefe mit translatierenden Polyribosomen assoziieren und dass PBP1 nach Nährstoffentzug auch in Stresskörnchen relokalisiert. Dies ist konsistent mit einer Rolle dieser beiden Proteine in der Regulation von Transkripten nach zellulärem Stress. Insgesamt schlage ich in dieser Studie vor, dass trypanosomales MKT1 an einer zentraler Stelle steht, um in der posttranskriptionaler Regulation verschiedener Transkripte auszuhelfen. Ich schlage vor, dass MKT1 diese Rolle durch direkte oder indirekte Bindung zahlreicher RBPs wahrnimmt, und dadurch die „ein Transkript- ein Regulator“ Modelle der Genregulation erweitert.