German Title: PI3K/AKT-Signalisierung ist endscheidend für die Kommunikation zwischen Gewebeinfiltrierten Mastzellen, Makrophagen und Epithelzellen in Kolitis-induziertem Krebs

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Abstract

Colorectal cancer is one of the leading cause of mortality in USA and worldwide. Colon cancer is a complex world of connective tissue epithelial, inflammatory and endothelial cell interactions. It s long known that patients with persistent colitis are at high risk of developing colon cancer, where the patients passes through a phase from colitis to colitis induced dysplasia and finally invasive cancer. Though a lot of efforts have been poured into understanding the mechanisms underlying the etiology of colon cancer, less has been known with respect to the changes happening at genomic and proteomic levels in the inflammatory compartment of the colon cancer with respect to interaction with the tumor epithelium and subsequent tumor progression. It is well known that the levels of PI3K/AKT and inflammatory cells mainly mast cells and macrophages are upregulated in the cancer. However, few efforts have been done to understand the pathogenesis in this direction, but they lacked in the correlative study of PI3K/AKT or immune infiltration in colon cancer or colitis and their spatial distribution with respect to cancer prognosis. Hence for the first time in this study a novel investigation was conducted where human patients were studied in the various stages of inflammation associated colonic illness i.e. colitis to dysplasia and invasive cancer and compared it to normal amongst themselves. The human-patient colonic tissue specimens were investigated for the spatial distribution of mast cells, macrophages and pAKT in the histological areas of musoca and submucosa. It was observed that mast cells, macrophages and pAKT levels incrementally rise from colitis to dysplasia to cancer in the submucosal tissues. In mucosal tissue, pAKT levels were found atleast 10 fold higher in the stromal cells in comparison with epithelial cells. The stromal and submucosal pAKT+ cells were found to be the macrophages that progressively infiltrate from colitis to dysplasia and invasive cancer, also mast cells were found to be high in pAKT activity. To investigate the role of PI3K/AKT in mast cells and macrophages biology and 4 their crosstalk with colonic epithelium a pan PI3K/AKT inhibitor used in clinical trials “LY2949002” was used. PI3K/AKT in mast cells was found to be critical for peripheral blood isolated human macrophage migration. LY294002 treatment of human and gut-derived murine mast cells restricted their ability to degranulate in dose-dependent manner. Moreover, inhibition of PI3K/AKT in human and mouse mast cells blocked the release of growth factors from them, and attenuated tumor proliferation and invasion promoting properties of mast cells. Also, PI3K/AKT inhibition in tumor infiltrating leukocytes isolated from colitis-associated patients lowered their soluble growth factor and cell-cell contact based tumor invasion promoting properties. Treatment of LY294002 using intra-peritoneal injections lowered the incidence of colitis associated invasive cancer development by day 56 in the Piroxicam treated IL-10-/- mice. LY294002 displayed a striking effect on the epithelial proliferation, induced tumor apoptosis and attenuated the pAKT levels. LY294002 showed special predilection for the pAKT+ stromal cells in comparison with pAKT+ epithelial cells. Moreover, frequencies of mast cells and granulocytebased inflammation were lowered after LY294002 treatment. Finally, the in situ degraunulating potential of mast cells was attenuated by LY294002 treatment. In conclusion, using in situ human patient specimen study, in vitro human and murine assays and in vivo mouse model system this study confirms the role of PI3K/AKT pathway in mast cells and tumor infiltrating leukocytes in crosstalk with the colonic epithelium and progression of colonic tissue from colitis.

Translation of abstract (German)

Das kolorektale Karzinom ist eines der häufigsten Todesarten weltweit. Das Kolonkarzinom ist eine komplexe Krankheit aus konvektivem epithelialem Gewebe, Entzündungen und endothelialen Zellinteraktionen. Es ist bekannt, dass Patienten mit persistenter Kolitis ein höheres Risiko haben Darmkrebs zu entwickeln. Diese Patienten gehen durch verschiedene Stadien der Kolitis. Diese entwickeln sich über eine Kolitis, welche die Dysplasie induziert und danach gehen diese zu invasiven Karzinome über. Obwohl viele Arbeitsgruppen zum Verständnis des Mechanismus der Ätiologie des Kolonkarzinoms beitragen, ist bis zum heutigen Zeitpunkt immer noch sehr wenig über die Veränderungen in der Genetik und die Proteomik bekannt. Dies gilt vor allem in den entzündlichen Teilen des Kolonkarzinoms in Bezug auf die Interaktion mit dem Tumorepithelium und der nachfolgenden Tumorprogession. Es ist bekannt, dass PI3K/AKT und entzündlichen Zellen, welche hauptsächlich Mastzellen und Makrophagen sind, im Karzinom erhöht sind. Jedoch ist bis zum heutigen Zeitpunkt sehr wenig zum Verständnis der Pathogenese in diesem spezifischem Feld beigetragen worden. Bis zum jetzigen Zeitpunkt sind noch keine korrelativen Experimente von PI3K/AKT und der immunen Infiltration im Kolonkarzinom, oder bei Kolitis und deren räumlichen Verteilung in der Karzinom-Prognose durchgeführt wurden. In dieser Arbeit wurden in den Patienten die verschiedenen Phasen der Entzündung, die mit Kolitis assoziiert sind, die danach zur Dysplasie übergehen und zum Schluss in invasiven Karzinom endet, untersucht und mit normalen Gewebe verglichen. Die Patientenproben aus dem Darmgewebe wurden auf die räumliche Verteilung der Mastzellen, Makrophagen und dem pAKT Level in der Mukosa und Submukosa histologisch untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass Mastzellen, Makrophagen und das pAKT Level schrittweise in der Kolitis über zur Dysplasie bis hin zum Karzinom im submukosalem Gewebe ansteigen. Im mukosalem Gewebe konnte ein über 10-facher Anstieg des pAKT Levels in den Stromazellen beobachtet werden im Vergleich zu dem Epithelzellen. Die Stroma- und submukosalen pAKT positiven Zellen wurden als Makrophagen identifiziert, welche schrittweise von der Kolitis über Dysplasie bis hin zum invasiven Karzinom infiltrieren. Des Weiteren wurde auch in den Mastzellen eine hohe pAKT Aktivität festgestellt. Um die Rolle von PI3K/AKT in Mastzellen und Makrophagen in Bezug auf deren Biologie und Wechselwirkung mit dem Kolonepithel zu untersuchen wurde der PI3K/AKT Inhibitor LY294002 verwendet, welcher auch in klinischen Trials zum Einsatz kommt. Das in Mastzellen gefundene PI3K/AKT wirkt sich kritisch auf die humane Makrophagen Migration aus, die aus peripheren Blut isoliert wurden. Die Behandlung mit LY294002 in humanen und murinen Darm-Mastzellen beschränkt deren Eigenschaften zu degranulieren in einer dosisabhängigen Weise. Darüber hinaus blockiert die Inhibition von PI3K/AKT in humanen und murinen Mastzellen die Freisetzung von Wachstumsfaktoren und verringert die Tumorproliferation und die fördernden Eigenschaften zur Invasion. Außerdem verringert die Inhibition von PI3K/AKT die in Tumoren infiltrierenden Leukozyten, isoliert aus Kolitis-assoziierten Patienten, deren löslichen Wachstumsfaktoren und Zell-Zell-Kontakte basierend an deren fördernden Eigenschaften zur Tumorinvasion. Die Behandlung mit LY294002 durch intraperitonealen Injektionen verringert die Kolitis Inzidenz assoziiert mit der Entwicklung von invasiven Karzinomen ab dem 56. Tag in IL-10-/- Mäusen, die mit Piroxicam behandelt wurden. LY294002 zeigte eine signifikanten Einfluss auf die epitheliale Proliferation, die Tumorinduzierte Apoptose und die Abnahme von pAKT. Darüber hinaus zeigte LY294002 eine spezielle Präferenz für die pAKT positiven Stromazellen im Vergleich mit den pAKT positiven Epithelzellen. Des Weiteren wurden die Frequenzen von Mastzellen und Granulozyten-basierende Entzündungen nach LY294002 Behandlung verringert. Schließlich wurde das in-situ degranulierende Potential der Mastzellen verringert. Zusammenfassend bestätigt diese Arbeit die Rolle des PI3K/AKT Signalweg in Mastzellen und Tumor infiltrierende Leukozyten in der gegenseitigen Beeinflussung des Koloneptheliums und die Progression des Kolongewebes von Kolitis über zum invasiven Karzinoms.