German Title: MDS1/EVI1 und PRDM16 Deregulierung in der Hämatopoese nach experimentellen und klinischen Gentransfer

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Abstract

Comprehensive integration site analysis in clinical gene therapy has shown that therapeutic vector integrations can lead to clonal selection and even malignant transformation by transcriptional activation of cellular proto-oncogenes. Assessing the clonal dynamics of gene corrected cells revealed an expansion of hematopoiesis marked with unique retroviral insertion sites mainly in the loci of MDS1/EVI1, PRDM16 and SETBP1 in two patients treated for correction of chronic granulomatous disease (CGD) 5 months after gene therapy. This cell population remained stable for additional 1.5 years. At later time points, both individuals developed a myelodysplastic syndrome (MDS) driven by gene-corrected cell clones carrying integrations in the MDS1/EVI1 locus. In this thesis, large scale integration site mapping using non-restrictive and highly sensitive linear amplification mediated polymerase chain reaction (LAM-PCR) focused on the gamma-retroviral integration monitoring within the two gene loci MDS1/EVI1 and PRDM16 in Wiskott - Aldrich syndrome (WAS) clinical gene therapy. Both WAS patients experienced substantial improvement in their clinical conditions, showing a polyclonal repopulation of the hematopoietic system after reinfusion of autologous ex vivo transduced hematopoietic progenitor cells. Although MDS1/EVI1 and PRDM16 were scored as common integration sites (CIS), and MDS1/EVI1 and PRDM16 containing clones were mostly restricted to the myeloid compartment of reconstituted hematopoiesis, no signs of clonal expansion related to these two genes were observed in both patients at 2 years follow up. We hypothesized that a concerted sustained or transient overexpression of MDS1/EVI1 and PRDM16 as pro-myelocytic key regulating transcription factors might be used to substantially influence proliferating and differentiation capacity of hematopoietic stem and progenitor cells. Therefore, murine Mds1/Evi1 and Prdm16 were cloned and expressed either by integration-proficient (LV) or integration-deficient lentiviral vectors (IDLV). Long-term Mds1/Evi1 and Prdm16 expression in hematopoietic progenitors driven by LV was achieved, as well transient expression by IDLV. However, no significant clonal expansion was observed after experimental overexpression of Mds1/Evi1 and Prdm16, as transduced cells became apoptotic after expression. To further assess the biosafety of IDLVs for clinical gene therapy we performed genome wide large-scale IDLV integration analysis in vitro, using conventional and non-restrictive LAM-PCR, as well as newly established two-directional LAM-PCR. This first ever large scale IDLV integration analyses yielded more than 800 unique, mappable IDLV ISs in vitro. Our data revealed a genome-wide close to random integration pattern without any preference for gene coding regions. The results also provided direct molecular evidence that the background integration of D64V mutant IDLVs is not mediated by residual catalytic activity of the mutant integrase. The risk of insertional mutagenesis events mediated by IDLV is highly minimized compared to their integration proficient counterparts and it provides one of the potentially safest tools for efficient gene delivery for clinical applications. The utilization of IDLVs for transient overexpressing is versatile, but warrants careful evaluation of potential toxic effects, as Mds1/EvI1 and Prdm16 as chosen transgenes to expand hematopoietic progenitors have shown.

Translation of abstract (German)

Die umfassende Analyse von Integrationsstellen gentherapeutischer Vektoren in klinischen Studien zeigte, dass die Integration des therapeutischen Vektors zu einer klonalen Selektion bis hin zu einer malignen Transformation durch transkriptionelle Aktivierung von Protoonkogenen führen kann. Untersuchungen zur klonalen Dynamik genkorrigierter Zellen in zwei Patienten im Rahmen der klinischen Gentherapiestudie zur Behandlung septischer Granulomatose (CGD) zeigte 5 Monate nach Therapie eine Expansion der Hämatopoese, die hauptsächlich von Zellklonen mit Vektorintegrationsstellen innerhalb oder in der Nähe der Gene MDS1/EVI1, PRDM16 und SETBP1 angetrieben wurde. Diese Zellpopulation blieb für weitere 1.5 Jahre stabil. Im späteren Verlauf entwickelten beide Pateinten ein myelodysplastisches Syndrom (MDS), ausgelöst durch genkorrigierte Zellen, welche Integrationen in dem MDS1-EVI1 Lokus aufwiesen. Für die Charakterisierung retroviraler Vektorintegrationsstellen im Rahmen der klinischen Studie zur Behandlung des Wiskott-Aldrich-Syndroms (WAS) mit Fokus auf die beiden genomischen Bereiche MDS1/EVI1 und PRDM16 wurde in dieser Arbeit die nicht-restriktive (nr) und die hochsensitive lineare amplifikations-mediierte Polymerasekettenreaktion (LAM-PCR) verwendet. In beiden WAS Patienten führte die Behandlung zu einer grundlegenden Verbesserung der klinischen Situation. Es zeigte sich eine polyklonale Repopulation des hämatopoetischen Systems nach Reinfusion ex vivo transduzierter autologer hämatopoetischer Vorläuferzellen. Obgleich sich sowohl bei MDS1/EVI1 als auch bei PRDM16 eine auffällige Häufung der Vektorintegrationsstellen zeigte („common integration sites“, CIS) und diese vorwiegend auf das myeloide System beschränkt waren, wurden in beiden Patienten bis zwei Jahre nach Therapie keine Anzeichen einer klonalen Expansion in Verbindung mit diesen beiden Genloki beobachtet. Wir stellten die Hypothese auf, dass eine gemeinsame fortwährende oder transiente Überexpression von MDS1/EVI1 und PRDM16, die beide wichtige Transkriptionsfaktoren im myeloiden System darstellen, verwendet werden könnte, um die Proliferations- und Differenzierungskapazität von hämatopoetischen Stamm- und Vorläuferzellen zu beeinflussen. Daher wurden die murinen Genloki MDS1/EVI1 und PRDM16 kloniert und mithilfe von Integrations-profizienten (LV) und Integartions-defizienten lentiviralen Vektoren (IDLV) exprimiert. In hämatopoetischen Vorläuferzellen konnte eine Langzeitexpression von MDS1/EVI1 und PRDM16 durch LV sowie eine transiente Expression durch IDLV erreicht werden. Es konnte jedoch keine signifikante klonale Selektion beobachtet werden, da die experimentelle Überexpression in den transduzierten Zellen Apoptose auslöste. Für die klinische Anwendung von IDLV wurde deren biologische Sicherheit weitergehend durch eine umfassende genomweite in vitro Integrationsstellenanalyse unter Verwendung der konventionellen und der nicht-restriktiven LAM-PCR, sowie einer neu entwickelten bidirektionalen LAM-PCR, untersucht. Diese im Hochdurchsatz angelegte Studie konnte erstmals mehr als 800 unterschiedliche, dem Genom eindeutig zuordenbare IDLV Integrate in vitro identifizieren und charakterisieren. Unsere Daten zeigten eine genomweite beinahe zufällige Verteilung von Integrationsstellen, ohne Präferenz für genkodierende Bereiche. Weiterhin erbrachten diese Daten erstmals den molekularen Beweis, dass die Hintergrund-Integration der D64V IDLV-Mutante nicht durch die residuale katalytische Aktivität der Integrase vermittelt ist. Das Risiko der insertionellen Mutagenese ausgelöst durch IDLV ist im Vergleich zu entsprechenden Integrations-profizienten Vektoren stark minimiert und somit könnte die Verwendung von IDLVs eines der potentiell sichersten Werkzeuge für einen effizienten Gentransfer in der klinische Anwendung darstellen. Die Verwendung von IDLV zur transienten Überexpression ist vielfältig, bedarf aber einer genauen Abwägung des potentiell toxischen Effekts, wie die beiden zur Untersuchung der Expansion hämatopoetischer Progenitoren ausgewählten Transgene MDS1/EVI1 und PRDM16 zeigten.