German Title: In vivo Studie des Zweikomponenten Signaltransduktions-Netwerkes in Escherichia coli

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Abstract

Microorganisms commonly use ‘two-component’ signaling systems for sensing environmental conditions, with members being present in nearly all bacterial and archaeal genomes in different numbers. Prototypical two-component systems are comprised of a sensory histidine kinase and a response regulator protein that is phosphorylated by the kinase. The regulator typically acts as a transcription factor regulating gene expression. Due to their prevalence in microorganisms, a basic understanding of the principles of two-component systems provides insights into mechanisms of prokaryotic signaling circuits. Apart from a few studies performed in vitro, the signaling properties of a whole bacterial two-component network in vivo remains largely unclear. Using a system level approach, we characterized the localization of signaling proteins and the interactions between pathways on different levels in the model bacterium Escherichia coli. We constructed a comprehensive library of fluorescent protein fusions to kinases and regulators from two-component systems, and applied fluorescence microscopy to analyze their spatial organization within the cell. We found that most of the sensors exhibit a intrinsic tendency for cluster formation, which might provide a scaffold for information processing and insulation against detrimental noise from other sources. We used in vivo FRET microscopy tools to study protein interactions in a systematic way. For kinases, we could confirm the formation of sensor dimers or higher order oligomers in vivo in most of the cases. For the sensor BaeS, we characterized the change of sensor confirmation upon stimulation. Additionally, we identified a few pathways exhibiting interconnections on the sensor level and between sensors and non-cognate regulators, providing an additional layer of information processing. We could confirm the physiological relevance of some of these pathway interconnections on the gene expression level, using flow cytometry measurements of a fluorescent promotor library. Moreover, using this library we found most of the reported stimuli not affecting two-component gene expression. Taken together, our data provide a deeper understanding of cellular organization within and interconnections between different two-component systems in E. coli. The results of this study can broaden the understanding of cell signaling principles in bacteria.

Translation of abstract (German)

Mikroorganismen verwenden meist "Zweikomponentensysteme" zur Wahrnehmung ihrer Umweltbedingungen und man findet sie in unterschiedlicher Zahl in den Genomen fast aller Bakterien und Archaeen. Ein typisches Zweikomponentensystem besteht aus einer Histidinkinase als Sensor und einem Antwortregulator, welcher von der Kinase phosphoryliert wird. Der Antwortregulator fungiert meist als Transkriptionsfaktor und reguliert die Genexpression. Aufgrund ihrer Verbreitung in Mikroorganismen ermöglicht ein grundlegendes Verständnis der Funktionsweise von Zweikomponentensystemen Einblicke in die Mechanismen prokaryotischer Signalverarbeitung. Trotz einiger in vitro Studien fehlt bisher die Beschreibung eines vollständigen Netzwerkes von Zweikomponentensystemen in vivo. In einer systemweiten Studie im Bakterium Escherichia coli haben wir die Lokalisierung von Signaltransduktionsproteinen und die Wechselwirkungen zwischen Systemen auf verschiedenen Ebenen untersucht. Dafür konstruierten wir eine umfassende Bibliothek von fluoreszenten Kinase- und Regulatorfusionen und analysierten ihre Lokalisierung innerhalb der Zelle mittels Fluorezenzmikroskopie. Wir sahen fü die meisten Sensoren eine intrinsische Tendenz zur Komplexbildung, welche wahrscheinlich ein Gerüst zur Informationsverarbeitung bietet und Systeme gegen störende Einflüsse von außen schützt. Mittels systematischer in vivo FRET-Mikroskopie untersuchten wir systematisch die Interaktionen zwischen den einzelnen Proteinen. Für die meisten Sensoren konnten wir die Bildung von Dimeren oder Oligomeren in vivo bestätigen. Den Sensor BaeS charakterisierten wir durch die induzierte Konformationsänderung auf Grund von Stimulationen. Zusätzlich fanden wir einige Signaltransduktionswege, welche auf Sensorebene oder zwischen Kinasen und nicht zugehörigen Regulatoren interagieren. Diese bilden eine weitere Ebene der Signalverarbeitung. Mittels Durchflusszytometrie und einer fluoreszenten Promotorkollektion konnten wir für einige dieser Interaktionen die physiologische Relevanz auf Genexpressionsebene bestätigen. Jedoch fanden wir keinen Effekt der meisten beschriebenen Stimuli auf die Genexpression von Zweikomponentensystemen. Abschließend liefern unsere Ergebnisse ein detailierteres Verständnis der räumlichen Organisation von E. coli Zweikomponentensystemen und deren Wechselwirkungen untereinander. Diese erweitern das Verständnis bakterieller Signaltransduktion.