German Title: Strukturelle Untersuchungen des Ethylensignaltransduktionswegs in Arabidopsis thaliana

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Abstract

Since ethylene was first recognized as a phytohormone, the scope of its profound and multi-faceted impact on plant growth and development has been continuously growing. In Arabidopsis thaliana the response to ethylene is regulated by a group of five receptors (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 and EIN4), which are located in the endoplasmic reticulum membrane. Ethylene is bound by the membrane-embedded N-terminal part, which is followed by a GAF domain. The remaining C-terminal, cytosolic domains resemble the classical bacterial two-component system consisting of a histidine kinase (HK) and in some receptors a receiver domain. Constitutive triple response 1 (CTR1), whose kinase domain bears most resemblance to the RAF family of Ser/Thr protein kinases, directly interacts with the ethylene receptors and thus links signal reception to the intracellular signalling pathway. Therefore, this signalling pathway presents the interesting case, wherein a two-component signalling system manipulates a MAPKKK and possibly a MAPKKK signalling cascade. Still, the question of receptor deactivation by ethylene and the ensuing signal transduction to CTR1 remain unanswered. A number of constructs comprising domains of the receptors as well as the kinase domain of CTR1 were expressed and purified. The dimerization domain (DHp) of ERS1 could be crystallized and solved by MAD to 1.9 Å resolution. The domain is structurally similar to other domains of this family, normally found in bacteria, consisting of a homodimer forming a coiled-coil and a four-helix bundle. Different to the previously available structures a larger portion of the N-terminal coiled-coil could be determined. When the DHp domain structure is compared with other HKs it is most similar to the phosphatase-competent state, one of the three activities attributed to HKs. A trans-phosphorylation mechanism in the dimer is predicted by topological arrangement of the structure. In addition SAXS data of the cytoplasmic part of ETR1 was collected and a model of the domain architecture is presented, showing their relative location with respect to each other. A different location of the receiver domain compared to a recent bacterial structure is suggested. In addition the three-dimensional structures of the active, tri-phosphorylated and the unphosphorylated, inactive kinase domain of CTR1 in complex with staurosporine were determined at 3.0 Å and 2.5 Å resolution, respectively. They illustrate the conformational rearrangements that form the basis of activity regulation. The active kinase domain forms back-to-back dimers in solution, while the unphosphorylated kinase is a monomer. The back-to-back dimer interface is virtually identical to the one found in B-RAF and a number of mutants were identified interfering with the dimerization and also affecting the kinase activity. Furthermore the effects of activation loop phosphorylation on the activity were explored. The results strongly suggest another layer of activity regulation of CTR1 through dimerization in vivo. Steric restraints further indicate regulation of kinase activity across dimers with a 'front-to-front' activation interface, which points to CTR1 mediated ethylene receptor crosstalk generating a continuous head-to-tail oligomer of kinase domains.

Translation of abstract (German)

Seit der Klassifizierung von Ethylen als Phytohormon ist das Wissen um seine weitreichende und facettenreiche Rolle und seinen Einfluss auf eine Vielzahl von Entwicklungs- und Wachstumsprozessen von Pflanzen stetig gewachsen. In Arabidopsis thaliana wird die Reaktion auf Ethylen durch eine Gruppe von fünf Rezeptoren reguliert (ETR1, ETR2, ERS1, ERS2 und EIN4), die im endoplasmatischen Retikulum verankert sind. Ethylen wird von der N-terminalen, in die Membran eingebetteten Domäne gebunden gefolgt von einer GAF Domäne. Die restlichen C-terminalen Domänen ähneln dem klassischen Zweikomponentensystem bestehend aus einer Histidinkinase (HK) und einer so genannten Empfängerdomäne die letztere jedoch in nur drei der Rezeptoren. Constitutive triple response 1 (CTR1), dessen Kinasedomäne jener der RAF Familie der Ser/Thr Kinasen ähnelt, interagiert direkt mit den Ethylenrezeptoren und stellt damit eine Verbindung zwischen der Signalerkennung und dem intrazellulären Signalübertragungsweg her. Dieser Signalübertragungsweg stellt einen interessanten Fall dar, in dem das Zweikomponentensystem eine MAPKKK und möglicherweise eine MAPKKK Signalübertragungskaskade kontrolliert. Trotz aller Fortschritte ist der genaue Ablauf der Rezeptordeaktivierung und der Übertragung des Signals auf CTR1 nicht bekannt. Eine Anzahl von Konstrukten, bestehend aus Domänen der Rezeptoren als auch der Kinasedomäne von CTR1 wurde exprimiert und gereinigt. Die Dimerisierungsdomäne (DHp) von ERS1 konnte kristallisiert und durch MAD, bis zu einer Auflösung von 1.9 Å, gelöst werden. Die Struktur ähnelt bakteriellen Strukturen dieser Domäne mit einem Homodimer bestehend aus einem coiled-coil und einem Vier-Helixbündel. Konträr zu anderen Strukturen konnte ein größerer Teil der Struktur des N-terminalen coiled-coil bestimmt werden. Der Vergleich der ERS1 DHp Domäne mit anderen Histidinkinasen legt den Schluss nahe, dass die beobachtete Struktur dem Phosphatase-kompetenten Status entspricht, einem von drei Aktivitätszuständen, die im Allgemeinen mit HK verbunden werden. Ein trans-Phosphorylierungsmechanismus des Dimers wird durch die Topologie der Struktur vorhergesagt. Zusätzlich wurden SAXS Daten der zytoplasmatischen Domänen von ETR1 gesammelt. Ein Modell der zytoplasmatischen Domänen wird präsentiert, mit deren relativen Positionen zueinander. Im Gegensatz zu einer bakteriellen Struktur befindet sich die Empfängerdomäne an einer anderen, weniger zentralen Position. Zusätzlich wurden die 3-D Strukturen der aktiven, dreifach phosphorylierten und der inaktiven, unphosphorylierten Kinasedomäne von CTR1 jeweils im Komplex mit Staurosporine bis zu einer Auflösung von 3.0 Å beziehungsweise 2.5 Å bestimmt. Sie veranschaulichen die strukturellen Änderungen, welche die Basis der Aktivitätsregulierung bilden. Die aktive Kinase liegt als ´Rücken-an-Rücken´-Dimer in Lösung vor, während die unphosphorylierte, inaktive Kinase als Monomer vorliegt. Die Kontaktfläche des ´Rücken-an-Rücken´-Dimers ist jener von B-Raf sehr ähnlich und mehrere Mutanten wurden untersucht, welche die Dimerisierung und zum Teil auch die Aktivität beeinflussen. Außerdem wurde der Einfluss der Aktivierungsschleifenphosphorylierung auf die Aktivität analysiert. Die Resultate deuten auf ein weiteres Level der Aktivierungsregulation durch Dimerisierung in vivo hin. Sterische Einschränkungen deuten auf eine Regulierung zwischen den Kinasedimeren über eine aktivierende ´Kopf-an-Kopf´ Interaktionsfläche hin, mit deutlichen Hinweisen auf eine, durch CTR1, vermittelte Kommunikation zwischen den Ethylenrezeptoren was zur Generierung eines kontinuierlichen Oligomers aus Kinasedomänen in einer Kopf-Schwanz-Anordnung führt.