German Title: Bindung von Hepatitis B Virus abgeleiteten Lipopeptiden an Serum Faktoren und Modellmembranen

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Abstract

Das Hepatitis B Virus (HBV) ist ein umhülltes hepatotropes Virus mit ausgeprägter Wirts-spezifizität. Zur Infektion von Hepatozyten benötigt es den N-terminalen Teil des großen Hüllproteins (Large-surface protein, L-Protein), besonders die essentielle Domäne (Aminosäuren 9-15) und die N-terminale Myristoylierung. Die HBV-Infektion kann durch Zugabe von geringen Mengen an acylierten Peptiden, welche dem N-Terminus des L-Proteins entsprechen (HBV präS/2-48myristoyl), effizient inhibiert werden (IC50: 400 pmol). Hierfür sind wieder die Korrektheit der essentiellen Domäne und die N-terminale Fettsäure von Bedeutung. Werden diese Peptide Mäusen injiziert, so ist ein ausgeprägter Lebertropismus zu beobachten. Eine Mutation in der essentiellen Domäne führt zum Verlust des Lebertropismus, das entfernen der Acylierung verursacht eine rasche Ausscheidung des Peptids. Dies deutet auf eine Fettsäure-abhängige Bindung des Peptides an einen Serumfaktor hin. In dieser Arbeit wurden zunächst solche Faktoren identifiziert und die Interaktion charakterisiert; im zweiten Abschnitt wurde die Membranaktivität dieser Peptide untersucht. Der dritte Teil beschäftigt sich mit der hepadnaviralen Infektion verschiedener Spezies. Serum Albumin und Apolipoprotein A1 wurden als acylierungs-abhängige, sequenz-unabhängige Bindepartner für HBV präS1-Peptide identifiziert. Das myristoylierte Peptid band Albumin mit geringer Affinität (KD =17μM), die Bindung an beide Faktoren stieg mit der Hydrophobizität des Peptids. Die Albuminbindung konnte in vivo bestätigt werden. Keiner der Faktoren hatte einen starken Einfluss auf die Bindung des Peptides an Hepatozyten, auf die HBV-Infektion oder auf die Infektionsinhibition. Diese Interaktionen stabilisieren also das Peptid im Serum, sie sind jedoch für weitere Schritte nicht relevant. Versuche, zelluläre Interaktionspartner für präS-peptide zu identifizieren, waren erfolglos. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der präS1-Domäne im viralen Zelleintritt untersucht. Da HBV ein umhülltes Virus ist, muss es während des Eintritts in die Wirtszelle sein Nukleokapsid freisetzen; die erste Transmembran-Domäne (TM-I), die den drei Oberflächenproteinen des Virus gemeinsam ist, wurde als virales Fusionspeptid beschrieben. Hier wurde die Membranaktivität des HBV präS1-Peptids analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Peptid Modellmembranen in Abhängigkeit der essentiellen Domäne und der N-terminalen Acylierung destabilisiert. Koflotations-Versuche zeigten eine acylierungs-abhängige Bindung an Liposomen. Dies deutet auf eine Rolle der präS1-Domäne im Zelleintritt hin. Der dritte Teil behandelt die Infektion von Hepatozyten verschiedener Spezies mit HBV, Hepatitis Delta Virus 2, ein Viroid, welches vermutlich den gleichen Zelleintrittsmechanismus verwendet wie HBV und Waldmurmeltier-HDV (Woodchuck-HDV, WHDV); letzteres ist ein Hepatitis Delta Virus, welches die Oberflächenproteine des Woodchuck-Hepatitis Virus trägt. Hierfür wurden primäre Hepatozyten von Ratte, Kaninchen, Hamster und Meerschweinchen isoliert und mit HBV, HDV oder WHDV infiziert. Ratten-Hepatozyten konnten weder mit HBV noch mit HDV infiziert werden. Kaninchen-Hepatozyten waren suszeptibel für HDV, jedoch nicht für HBV. Sowohl in Hamster- als auch in Meerschweinchen-Hepatozyten war eine HBV-Infektion, jedoch keine HDV-Infektion detektierbar. Alle getesteten Hepatozyten waren suszeptibel für eine WHDV-Infektion. Diese Daten weisen darauf hin, dass der HBV-Rezeptor auch in anderen Spezies vorhanden ist. Die Restriktion der verschiedenen Infektionnen findet vermutlich an einem späteren Schritt statt und ist für HDV und HBV verschieden.

Translation of abstract (English)

Hepatitis B Virus (HBV) is an enveloped, hepatotropic virus with a restricted host range. Infection of hepatocytes has been shown to require the N-terminal part of the large envelope protein (L-protein); intactness of the essential site (amino acids 9-15) is crucial, the N-terminal myristoylation is mandatory. HBV infection is efficiently inhibited by lipopeptides corresponding to the N-terminus of the L-protein (HBV preS/2-48myristoyl). Equally requiring the essential site and the N-terminal acylation, these peptides prevent HBV infection already at picomolar concentrations (IC50: 400 pmol). These features are also important for a marked liver tropism that is observed when preS-peptides are injected into mice. While a non-acylated peptide gets rapidly excreted from the body, a mutant acylated peptide is retained but loses its liver specificity, arguing for an acylation-dependent serum factor binding. In this work, serum factor binding and membrane activity of these peptides were analyzed; a third part addressed hepadnaviral infection of different species. First, serum albumin and apolipoprotein A1 have been identified as acylation-dependent, sequence-independent interaction partners for HBV preS-derived lipopeptides. The myristoylated peptide bound albumin with relatively low affinity (KD =17μM), binding to both serum factors was found to increase with hydrophobicity. Albumin binding was confirmed in vivo. None of the identified factors had a marked effect on peptide-binding to hepatocytes, HBV infection or infection inhibition. It was therefore concluded that these interactions stabilize the peptide in the serum but are not required for further steps. Attempts to identify protein binding partners for preS-peptides on hepatocytes were unsuccessful. In the second part, the focus turned towards viral entry. Being an enveloped virus, HBV has to release its nucleocapsid during viral entry; the first transmembrane-domain (TM-I), common to the three surface proteins, has been proposed as viral fusion peptide. Here, a possible role of the N-terminal part of the L-protein during this step was studied by analyzing the membrane activity of preS-derived peptides. They could be shown to destabilize model membranes depending again on the essential site and the acylation; coflotation assays demonstrated acylation-dependent association to liposomes. This indicates a possible involvement of the L-protein N-terminus in viral fusion. In the third part, it was assessed whether other hepatocytes from small animals belonging to different orders show susceptibility to HBV, to hepatitis delta virus 2, a viroid thought to share a common entry pathway with HBV, or to woodchuck hepatitis delta virus (WHDV), an HDV-virus containing the envelope proteins from woodchuck hepatitis virus. Primary hepatocytes from rat, rabbit, hamster and guinea pig were therefore isolated and infected with HBV, HDV or WHDV. Rat hepatocytes could not be infected, neither with HBV nor with HDV. Rabbit hepatocytes showed susceptibility to HDV, but not to HBV. In both hamster and guinea pig hepatocytes, HBV infection but no HDV infection was observed. All primary hepatocytes were susceptible to WHDV. These findings indicate that the receptor for HBV is also present in other species; restriction of infection probably occurs at a post-entry step and affects HDV and HBV separately.