German Title: Untersuchung der Nahrungsvakuolen von Plasmodium knowlesi

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Abstract

Die Nahrungsvakuole ist der Ort an dem der Abbau des Hämoglobins im Malaria Parasiten stattfindet; diese Vakuole ist einzigartig für den Genus Plasnodium und repräsentiert somit ein unschätzbares Ziel zur Entwicklung für Anti-Malaria Komponenten. Diese Organelle und der wichtige Prozess, der in ihr ablauft, ist sehr gut karakterisiert für P. falciparum, für andere Malaria Arten des Menschen jedoch fehlt das Wissen über die Art dieser zellulären Komponente. Auf Grund der Vorliebe von P vivax für eine bestimmte Wirtszelle, bleibt die in vitro Kultur des Parasiten eine Herausforderung. Ein Ausweg bietet der nah verwandte Malaria Parasit, P. knowlesi: Die an eine in vitro Kultur angepassten Stämme und ein vor kurzem entwickeltes Transfektionssystems kennzeichnen diesen Parasiten als vielseitiges Werkzeug, um eine ‘vivax-ähnliche’ Biologie zu studieren. Die Biologie der Nahrungsvakuole von P. knowlesi, der auch Zoonose- Krankheiten beim Menschen verursachen kann, wird in den Studien zu dieser Diplomarbeit beschrieben; die Zielsetzung der Arbeit war es, die Unterschiede hervorzuheben, die zwischen verschiedenen Parasitenarten bestehen können. Um die Morphologie der Nahrungsvakuolen der phylogenetisch verwandten Parasiten P. vivax, P. knowlesi und P. cynomolgi mit P. falciparum zu vergleichen, ist eine Kombination von Färbetechnicken und ‘life-time’ konfokaler Mikroskopie verwendet worden, die die Expression von fluoreszierenden Fusionsproteinen innerhalb der Vakuole zeigt. Verschiedene Arten von Nahrungsvakuolen, die aktief Hämoglobin abbauen, waren in Parasiten vom ‘vivax’-Typ zu beobachten, im Gegensatz zu einer einzigen, großen Nahrungsvakuole, die in P. falciparum zu sehen war. Zusätzlich ist Elektronenmikroskopie verwendet worden, um diese Studien zu ergänzen. PlasmepsinIV (PM4) ist eines der Schlüsselenzyme, die am Abbau von Hämoglobin beteiligt sind. Das pkpm4 Gen in P. knowlesi wurde so verändert, dass es eine Kopie von pkpm4 hervorbringt, die eine FKBP (‘FK506 binding protein’)-Destabilisierungsdomäne (DD) enthält. Dieses veränderte Gen kreiert Parasiten, die ein unstabiles PkPM4 Protein hervorbringen, das nur in Gegenwart von der Komponente Shield-1 stabil ist. In einem aminosäurelimitierenden Medium sind Parasiten abhängig von dem Abbau des Hämoglobins als Aminosauerequelle. In Abwesenheit von Shield-1 bleiben die Parasiten lebensfähig, aber ein aminosäurelimitierendes-Medium wirkt sich negativ sowohl auf das Aussehen wie auf das Wachstum der pkpm4DD Parasiten aus, während der Wildtyp P. knowlesi unberührt bleibt. Hiermit wird die Rolle des PKPM4 für den Aminosäureabbau unterstrichen Dies Resultat suggeriert aber auch, daß das Enzym nicht essentiell ist für die asexuelle Lebensfähigkeit des Parasiten. Die Nahrungsvakuole wird auch als Ziel für Chloroquine gesehen, ein Medikament, das viele Jahre lang erfolgreich eingesetzt wurde, um die menschliche Malaria zu behandeln. Durch das Entstehen von Resistenzen ist Chloroquine heutzutage weniger effizient in der Behandelung von Malaria verursacht durch P. falciparum. Mutationen in PfCRT, einem ‘channel-like’ Protein auf der Membran der Nahrungsvakuole sind in die Chloroquine-Resistenz bei P. falciparum verwickelt, obwohl keine Mutationen in dem homologen PvCRT Protein in resistenten P. vivax Parasiten identifiziert wurden, was auf einen Unterschied im Resistenz-Mechanismus der beiden Parasiten hinweist. Um zu bewerten, ob PfCRT fähig ist die Empfindlichkeit gegen das Medikament zu verändern, wurde ein Chloroquine-resistentes PfCRT Allel in P. knowlesi überexprimiert. Dieser Versuch resultierte in einer vierfach ansteigenden Toleranz gegen Chloroquine in einem Parasiten vom ‚vivax-Typ’, was darauf hinweist, dass PfCRT fähig ist, die Chloroquine Toleranz in einem ‚nonfalciparum’ Parasiten zu modifizieren. Diese Studien zeigen die Bedeuting eines vielseitigen in vitro Kultur- und Transfektionssystems in einem Parasiten, der phylogenetisch nah verwandt ist mit dem zweitwichtigsten Malariaparasiten, und nutzen es um einige Hauptunterschiede hervorzuheben, die zwischen verschiedene Parasiten bestehen bezüglich der Zielorganelle für das Medikament. Forschung an fundamentalen biologischen Prozessen von P. knowlesi kann uns Einsichten verschaffen in die Biologie von ‚vivax-ähnlichen’ Parasiten und uns zudem ein unverzichtbares Hilfsmittel zur Verfügung stellen für Studien an Medikamenten und Impfstoffen.

Translation of abstract (English)

The food vacuole, the site of haemoglobin degradation in malaria parasites is unique to the Plasmodium genus and therefore represents an invaluable target for the development of antimalarial compounds. This organelle and the essential process which occur within it, have been well characterised in P. falciparum, however knowledge is lacking as to the nature of this cellular compartment in other human malaria species. Due to the restricted host cell preference of P. vivax, in vitro culture of the parasite remains a challenge. The in vitro cultureadapted strains of the closely related primate malaria P. knowlesi and its recently developed transfection system, identify this parasite as a versatile tool to study “vivax-like” parasite biology. In the studies described in this thesis, the food vacuole biology of P. knowlesi (which also causes zoonotic disease in humans) is investigated to highlight differences in this organelle which may exist between parasite species. To compare the food vacuole morphology of the phylogenetically related parasites P. vivax, P. knowlesi and P. cynomolgi with P. falciparum, a combination of staining techniques and expression of fluorescent fusion food vacuole-resident proteins with live confocal microscopy is used. Multiple food vacuoles which are actively degrading haemoglobin were observed in the “vivaxtype” parasites, in contrast to a single, large food vacuole in P. falciparum. Electron microscopy is also used to complement these studies. PlasmepsinIV (PM4) is one of the key enzymes involved in haemoglobin degradation. The pkpm4 locus in P. knowlesi was modified to generate a copy of pkpm4 tagged with the FKBP (FK506 binding protein)-destabilisation domain (DD), creating parasites (pkpm4DD) which express an unstable PkPM4 protein which is only stabilised in the presence of the compound Shield-1. In amino acid-limited medium, parasites depend on haemoglobin degradation for a source of amino acids. In the absence of Shield-1, the parasites remain viable but there is a detrimental effect on both appearance and growth rate of pkpm4DD parasites in amino acid-limited medium, while the wild-type P. knowlesi remains unaffected, highlighting the role of PkPM4 in haemoglobin degradation, but suggesting that the enzyme is not essential for asexual viability. The food vacuole is also the proposed target for chloroquine, a drug which was successfully used to treat human malaria for many years, but is now dramatically less efficient for the treatment of P. falciparum due to the emergence of resistance. Mutations in PfCRT, a channel-like protein on the food vacuole membrane are implicated in chloroquine resistance in P. falciparum although no mutations in the PvCRT homologue have been identified in resistant P. vivax, indicating a difference in resistance mechanism of both parasites. To evaluate if PfCRT is capable of modulating drug susceptibility in a “vivax-type” parasite, a chloroquine resistant PfCRT allele was overexpressed in P. knowlesi, resulting in a four-fold increase in tolerance to chloroquine, indicating that PfCRT is capable of modulating chloroquine sensitivity in a “non-falciparum” parasite. These studies demonstrate the value of a versatile in vitro culture and transfection system in a parasite phyogenetically closely related to the second most important human malaria parasite, and utilise it to highlight some key differences which exist between malaria species in an important drug target. Research on P. knowlesi into fundamental biological processes can provide important insight into “vivax-like” parasite biology, as well as provide an indispensable tool for drug and vaccine studies.