English Title: Stress dependent ribonucleoprotein complex formation in the control of prothrombin gene expression

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Abstract

Die 3´Endprozessierung ist neben dem Capping und Spleißen ein wichtiger posttrans-kriptioneller Genexpressionsmechanismus. Die Prothrombin (F2) mRNA ist ein Prototyp für eine Genfamilie, die ein ungewöhnliches RNA Sequenz Motiv in der 3´ untranslatierten Regi-on aufweist. Stromaufwärts des Polyadenylierungssignals befindet sich ein Sequenzelement (USE), welches die 3´Endprozessierung sequenz- und positionsanhängig stimuliert. Dabei fungieren interessanterweise einige Spleißfaktoren (hnRNPI, U2AF35 und U2AF65) als posi-tive F2 USE-Effektorproteine, indem sie den kanonischen 3´Endprozessierungsapparat an die prä-mRNA rekrutieren. Des Weiteren wurden AU-reiche elementbindende Proteine (sog. ARE-BPs) als hochaffine und spezifische F2 USE Interaktionspartner identifiziert, deren po-tentielle Bedeutung in der 3´Endprozessierung bisher nicht beschrieben und analysiert wurde. Ziel dieser Arbeit war es die Ribonukleoprotein (RNP) Komposition exemplarisch an dem F2 USE Motiv unter Stressbedingungen zu analysieren und dessen Einfluss auf die Regulation der 3´Endprozessierung zu untersuchen. In molekularen Analysen des F2 USE RNP Komplexes konnte gezeigt werden, dass die meis-ten ARE-BPs direkt und spezifisch an das USE Motiv binden. Stress führt zur Hyperphospho-rylierung von einigen der ARE-BPs (FBP2 und FBP3) und reduziert deren Bindungsaffinität zum F2 USE Motiv. Somit scheinen die FBPs als Stresssensoren zu fungieren, wodurch die Komposition des F2 USE RNP Komplexes dynamisch an physiologische Prozesse angepasst werden kann. Diese und weitere im Labor generierten Daten deuten darauf hin, dass FBP2 und FBP3 wahrscheinlich stressabhängig mit den positiven USE-Effektorproteinen um die Bindung an das F2 USE Motiv konkurrieren. Um die Frage zu beantworten, ob die 3´Endprozessierung der F2 mRNA unter Stressbedin-gungen reguliert wird, wurden stabile Reporter-Zelllinien generiert. In Stressexperimenten verhielten sich die stabilen Zellklone sehr heterogen bzgl. der Regulation der 3´Endprozessierung, was möglicherweise mit der zufälligen Integration der Tandemreporter in das Genom zu erklären ist. Trotz dieser Variabilität deuten aber diese in vivo Daten auf eine USE-abhängige Regulation der 3´Endprozessierung hin, was jedoch mit neuen experimentel-len Ansätzen wie zum Beispiel lokusspezifischen, stabil transfizierten Zelllinien zu prüfen ist. Insgesamt zeigt die hier vorgestellte Arbeit, dass die regulierte 3´Endprozessierung eine be-deutende Rolle bei der stressabhängigen Adaptation der Genexpression spielt.

Translation of abstract (English)

The mRNA 3´end processing is an important posttranscriptional gene expression control mechanism. The prothrombin (F2) mRNA is a prototype for a gene family which has an un-usual RNA sequence motif in their 3´untranslated region. In this mRNA, an upstream se-quence element (USE) is located 30 nucleotides upstream of the polyadenylation signal, which stimulates 3´end processing in a sequence- and position dependent manner. Interest-ingly, some splicing factors (hnRNPI, U2AF35 und U2AF65) act as positive F2 USE effector proteins by recruiting the canonical 3´end processing machinery to the pre mRNA. Further-more AU-rich element binding proteins (so called ARE-BPs) were identified to interact with the F2 USE with a high affinity and specificity. So far their role in 3´end processing is not described and analysed. The aim of this study was to analyse the ribonucleoprotein (RNP) composition at the F2 USE motif under stress conditions and to investigate their influence in the regulation of 3´end processing. Molecular analysis showed that most of the ARE-BPs bind directly and specifically to the F2 USE motif. Stress hyperphosphorylates some of the ARE-BPs (FBP2 and FBP3), which re-sults in a reduced binding affinity to the F2 USE motif. FBPs thus seem to act as stress sen-sors that dynamically modulate the F2 USE RNP complex in response to physiological condi-tions. These and further data of the lab indicate a stress dependent competition of FBP2/3 and the positive USE effector proteins at the F2 USE motif. In order to answer the question, if F2 3´end processing is regulated under stress conditions, stable cell lines were generated. These cell lines were exposed to stress and observed to be-have differently in the regulation of 3´end processing. This is maybe due to the random inte-gration of the tandem reporter into the genome. In spite of the variability, these in vivo data indicate an USE dependent regulation of 3´end processing. Further experimental settings i.e. based on locus specific stable cell lines are expected to further validate these findings. Alto-gether these data indicate that regulated 3´end processing plays an important role in stress dependent adaptation of gene expression.