German Title: Auswirkungen der Alkaloide Harmin, Emetin und Sanguinarin auf menschliche Krebszellen

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Abstract

Über 21000 Alkaloide konnten bisher identifiziert werden. Hiermit stellen sie die größte Gruppe der stickstoffhaltigen Sekundärstoffe dar. Viele dieser Alkaloide sind für Tiere oder Menschen giftig. Die medizinische Nutzung von Alkaloiden kann als Ausnutzung von Eigenschaften angesehen werden, die eigentlich aus ökologischen oder evolutionsbedingten Gründen entwickelt wurden. Während der letzten Jahrzehnte rückte vor allem das krebsbekämpfende Potential der Alkaloide in das Zentrum des Interesses. Mehrere Alkaloide werden seit über 40 Jahren als Krebsmedikamente genutzt. In dieser Studie wurde die Cytotoxozität der drei Alkaloide Harmin, Emetin und Sanguinarin in den menschlichen Krebszelllinien MCF-7, HeLa und SiHa ermittelt. Die Ergebnisse des MTT-Assays zeigten, dass diese Alkaloide eine zelluläre Cytotoxizität aufweisen und einen zeit- und dosisabhängigen Zellzyklusarrest induzieren. Telomere und Telomerasen stellen aufgrund ihrer speziellen Struktur oder ihrer krebsrelevanten Eigenschaften interessante Ziele für die Krebsforschung dar. Es konnte nachgewiesen werden, dass einige natürlich vorkommende Alkaloide die Aktivität der Telomerase inhibieren. In unserer Studie wurde zuerst untersucht, ob Harmin, Emetin und Sanguinarin menschliche Telomerase inhibieren können. Durch den TRAP-Assay konnte nachgewiesen werden, dass alle drei Stoffe die Telomeraseaktivität in den Zelllinien inhibieren können, wenn die Zellüberlebensrate nach der Behandlung auf 70% reduziert wurde. Ein Vergleich der Inhibitionsrate aller Alkaloide zeigte, dass Harmin eine stärkere Inhibition aufwied als Emetin oder Sanguinarin. Um die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen wurde Harmin einer näheren Untersuchung in den zwei Krebszelllinien MCF-7 und HeLa unterzogen. Hierdurch konnten wir nachweisen, dass Harmin zwar in beiden Zelllinien die Telomeraseaktivität signifikant herabsetzt, aber die zugrunde liegenden Mechanismen durchaus unterschiedlich sind. Harmin induzierte eine Herunterregulierung der Expression von hTERT mRNA in MCF-7-Zellen. In HeLa-Zellen verursachte Harmin das alternative Splicing von hTERT, begleitet von einem Anstieg der nichtfunktionellen β-Splice-Form. Es wurde bereits gezeigt, dass Harmin DNA-Schädigungen hervorruft. Diese Resultate konnten wir in unserer Studie bestätigen. Durch ein β-Galactosidase-Staining und mehrere Western-Blot-Analysen konnten wir beobachten, dass die kontinuierliche Gabe von Harmin DNA-Schädigung auslöst. Die behandelten MCF-7-Zellen alterten schneller durch den p53/p21-Pathway. Zusammenfassend legen unsere Daten nahe, dass die Cytotoxizität von Harmin zumindest teilweise durch die Inhibition der menschlichen Telomerase bedingt ist.

Translation of abstract (English)

Over 21,000 alkaloids have been identified, which thus constitute the largest group among the nitrogen-containing secondary metabolites. Many alkaloids have shown their powerful toxicity towards animals or humans. The medicinal use of alkaloids could be regard as an exploitation of properties that originally had been selected and developed in an ecological or evolutionary context. During the past decades, more attention has been drawn on their anticancer potencies. A number of alkaloids have been used as anticancer drug over 40 years. In this study, the cytotoxicity of three alkaloids harmine, emetine, and sanguinarine were selected and evaluated in human cancer cells including breast cancer cell MCF-7, cervical cancer cell HeLa and SiHa. Results obtained from MTT assay showed that these alkaloids exhibited cellular cytotoxicity against human cancer cells and induce cell cycle arrest in dose- and time- dependent manner. Telomeres and telomerase have become interesting targets for anticancer research based on their special structure or cancer-associated character, some natural alkaloids have been identified are able to inhibit telomerase activity. In our study, we firstly investigated whether the alkaloid harmine, emetine, and sanguinarine were able to inhibit human telomerase. Data obtained from TRAP assay indicated that when the cell viability of each cell line was remaining around 70% after the treatment of each drug, all the compounds exhibited an inhibitory effect on human telomerase. Compared the inhibitory rate between each alkaloid, harmine initiated a greater reduction than that of emetine or sanguinarine. To elucidate the underlying mechanisms, harmine was especially selected and applied in parallel in two cancer cell lines MCF-7 and HeLa in further research. We have found that although harmine could significantly inhibit the telomerase activity in both cell lines, the mechanisms were quite different. Harmine induced a down-regulation of the expression of hTERT mRNA in MCF-7 cells, whereas it regulated the hTERT alternative splicing accompanied by an increase of the non-functional β splice form in HeLa cell. Harmine has been documented is able to trigger DNA damage, we have obtained the consistent results in our study as well. By applying β-galactosidase staining and a series of western blotting analysis, we observed that the chronic treatment of harmine initiated a DNA damage response, and the treated MCF-7 cells eventually entered an accelerated senescence status through p53/p21 pathway. Taken together, our data suggest that the cytotoxicity of harmine might be generated, at least partially, by the inhibitory effect on human telomerase.