English Title: Strategies towards a causal gene therapy of a hereditary cardiomyopathy utilizing adeno-associates viruses for specific gene transfer in animal models

Preview

PDF, German Download (61MB) | Terms of use

Abstract

Die Duchenne Muskeldystrophie ist eine ist eine X – Chromosomal rezessive Erkrankung, welche durch den Verlust des Dystrophins zu einer Skelettmuskeldystrophie mit einer Beteiligung des Herzens (Kardiomyopathie) führen kann. Da konventionelle Therapien jedoch keine Heilung ermöglichen, könnte ein Gentransfer mittels Adeno-assoziierter Viren (AAV), einen Therapieansatz darstellen. Daher wurde das Potential transkriptionell und transduktionell zielgerichteter AAV hinsichtlich der Effizienz und Spezifität bei systemischer Applikation in Mäusen untersucht. Die verwendete Kombination aus AAV9 und dem CMV verstärkten Myosin – Leichtketten Promotor (CMV-MLC1.5kb) zeigte gegenüber AAV2(R484E;R585E) und CMV-MLC1.5kb eine höhere Transduktionseffizienz im Herzen. Im anschließenden Vergleich des CMV-MLC1.5kb mit dem unspezifischen CMV – Promotor konnte eine höhere transkriptionelle Effizienz und Spezifität zu Gunsten des kardial spezifischen Promotors erzielt werden. Als Voraussetzung zur Verpackung größerer Transgene in AAV wurde ein auf 260 Basenpaare (bp) verkürzter CMV-MLC hinsichtlich der Effizienz und Spezifität einer kardialen Transkription untersucht. Da die kardiale Transkriptionseffizienz im Vergleich zum CMV-MLC1.5kb unverändert war, wurde die Kombination aus CMV-MLC0.26kb und AAV9 für einen kardialen therapeutischen Gentransferansatz gewählt. Als Tiermodell diente die Duchenne Muskeldystrophiemaus (Mdx), welche aufgrund einer X – chromosomalen Punktmutation eine Kardiomyopathie entwickelt. Aufgrund phänotypischer Unterschiede des in dieser Arbeit verwendeten Mausstammes zu dem in der Literatur beschriebenen Originalstamm, wurde eine Geno und Phänotypisierung vorgenommen, um die Vergleichbarkeit beider Stämme zu untermauern. Auch wenn genomweit nur eine 75%ige Übereinstimmung beider Stämme erreicht werden konnte, so zeigte das X Chromosom eine 100%ige Übereinstimmung mit dem Originalstamm. Auch bei weiteren Parametern, wie Histopathologie, Blutwerten und kardialen Funktionsmessungen, konnten keine gravierenden Abweichungen zum Originalstamm gezeigt werden, weshalb beide Linien als gleichwertig gelten. Daraufhin wurden die verfügbaren Mdx – Mäuse mit einer verkürzten Dystrophin cDNA (µDys), verpackt in AAV9 und unter der Kontrolle des CMV-MLC0.26kb bzw. CMV Promotors, systemisch behandelt. Im direkten Vergleich zeigte sich, dass der CMV-MLC0.26kb durch eine hohe Transduktionseffizienz des Herzens gegenüber dem CMV Promotor überlegen ist. Selbst bei Tieren, welche in hohem Alter (42 Wochen) injiziert wurden, war eine erfolgreiche Expression des µDys unter Kontrolle des CMV-MLC0.26kb Promotors zu beobachten. Um eine systemische Applikation in größeren Tieren und Menschen zu ermöglichen, wurde ein Gentransfer mit dem kardial spezifischen CMV-MLC1.5kb Promotor in Ratten getestet. Dazu wurden mit AAV6 bzw. AAV9 beladene Mikrosphären durch Applikation eines transthorakalen Ultraschalls im Herzlumen zerstört. Dies führte im Vergleich zur systemischen Applikation ohne Mikrosphären zu einer höheren Spezifität und Effektivität der kardialen Transduktion. Die Sicherheit dieser Applikationsmethode konnte durch das Ausbleiben gewebespezifischer Komplikationen (Hämorrhagien, Arrhythmien) bestätigt werden. Somit könnte die Anwendung dieser Herzmuskel spezifischen Applikation in Kombination mit transkriptionell und transduktionell an das Zielgewebe angepassten AAV neue Wege in der Therapie von angeborenen Kardiomyopathien beim Menschen eröffnen.

Translation of abstract (English)

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a rezessive X-linked disorder. Mutations within the dystrophin encoding gene can lead to a complete loss of the protein, causative for the Duchenne muscular dystrophy, frequently associated with severe cardiomyopathy. While conventional therapies can only alleviate the symptoms of the disorder temporarily, gene therapy approaches, like adeno-associated viral vector (AAV) – dependent gene transfer, may reconstitute the patients cardiac status. To achieve an enhanced cardiac specific gene delivery after systemic application in mice, transductionally and transcriptionally targeted AAV vectors have been tested. The combination of AAV serotype 9 (AAV9) and the CMV enhanced myosin light chain promoter (CMV-MLC1.5kb) leads to an increased cardiac reporter gene transduction superior to AAV2(R484E;R585E), a vector with reduced hepatic uptake due to ablation of binding the AAV2 primary receptor hepapran-sulfate-proteoglycane. Furthermore, the combination of AAV9 and CMV-MLC1.5kb promoter revealed an increased cardiac transcription efficiency and specificity compared to the unspecific CMV promoter (CMV). In order to meet the packaging limit of double stranded AAV vectors the MLC promoter sequence was reduced to 260 base pairs (bp). Comparing luciferase activities in cardiac tissue of animals either injected with the CMV-enhanced MLC0.26kb promoter (CMV-MLC0.26kb) or the CMV-MLC1.5kb promoter resulted in a similar gene transfer efficiency. Due to the high efficiency and specificity of cardiac gene transfer with AAV9, the CMV-MLC0.26kb promoter was used for a therapeutic gene transfer to myocardium of mice. In order to investigate the benefit of therapeutic gene transfer, the Duchenne muscular dystrophy mouse (Mdx) was chosen as an animal model of an inherited cardiomyopathy. Comparing the available Mdx strain with the originally described Mdx strain revealed minor phenotypic differences between both strains. The genotyping resulted in only 75% genomic congruency. However, no differences were found for the X-chromosome, the origin of the dystrophin mutation. In addition, phenotypic studies of the accessible strain could not reveal major differences between the available strain and published data. After demonstrating the comparability of both strains, Mdx mice were systemically injected with AAV9 harbouring a truncated Dystrophin cDNA (µDys) under the transcriptional control of either the CMV-ML0.26kb promoter or the CMV promoter. Direct comparison of both vector constructs revealed an efficient and cardiac specific expression of µDys with the CMV-MLC0.26kb promoter, that was superior to the CMV promoter. Even in 42 weeks old Mdx mice, an efficient and specific myocardial µDys expression could be observed after systemic application using the CMV-MLC0.26kb promoter. In order to enhance cardiac transduction in systemic application of larger animals or patients, AAV6 and AAV9 vectors harbouring a luciferase reporter gene under transcriptional control of the CMV-MLC1.5kb promoter were attached to gasfilled lipid bubbles (microbbbles). A constant transthoracic ultrasound was applied during AAV-loaded microbubble administration in rats. Thereby, the microbubbles burst within the cardiac vessels and facilitate transduction of the myocardium. In contrast to systemic application of AAV vectors in rats, the application of AAV-loaded microbubbles in combination with ultrasound revealed an increased efficieny and specificity of myocardial transduction. The absence of side effects (haemorrhagia, arrhythmia) after application of AAV-loaded microbubbles ensured the safety of this application method. In conclusion, the combination of a cardiac specific application method with transcriptionally and transductionally targeted AAV vectors may enable new approaches in therapy of inherited cardiomyopathies in men.