English Title: Study of the retroviral entry on a single particle level by fluorescent microscopy

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Abstract

HIV-1 ist in den letzten drei Jahrzehnten im Fokus intensiver Forschung gewesen. Trotzdem sind die frühen Schritte des Zelleintritts noch nicht im Detail verstanden. Die Fusion und die direkt nachfolgenden Schritte der Virusinfektion sind mit den herkömmlichen biochemischen und virologischen Ensemblemessungen nur auf Kosten der Zeitauflösung und durch die Verwendung artifizieller Synchronisationsmethoden zu adressieren. In dieser Arbeit wird die virale Fusion mittels live cell imaging auf Einzelpartikelebene untersucht. Dazu war die Etablierung eines auf Fluoreszenzsignalen beruhenden Indikators für Fusion nötig. Um dies zu erreichen wurden bereits vor dieser Arbeit an inneren Partikelstrukturen fluoreszenzmarkierte HIV-Partikel mit einer zusätzlichen Fluoreszenzmarkierung in der Virusmembran versehen. Die Membranmarkierung sollte im Moment der Membranfusion an der zellulären Membran verbleiben und sich so von der ersten Fluoreszenzmarkierung trennen. Als effektive membranmarkierungsmethode stellte sich die Pseudotypisierung der HIV-Partikel mit MLV.Env.YFP heraus. Gegenüber dem HIV-Hüllprotein besitzt das MLV-Hüllprotein eine hohe Fusogenität, was für die Detektion von Fusionen einzelner Partikel ein Vorteil ist. Um die Detektionswahrscheinlichkeit einzelner Fusionsereignisse weiter zu erhöhen, wurde ein neuer Versuchsaufbau in der Abteilung etabliert. Das gewählte Verfahren erlaubte die einfache Quantifizierung der Virus-Zell-Interaktionen. Nach ausführlicher Charakterisierung wurden mittels eines automatisierten Virustracking-Algorithmus mehr als 20.000 einzelne Partikel verfolgt und 28 Fusionen auf Einzelpartikelebene als Farbtrennungsereignisse detektiert. Um die frühen Ereignisse der Infektion besser zu verstehen, wurden die inneren Partikelstrukturen über unterschiedliche fluoreszenzmarkierte HIV-Proteine visualisiert. Das Verhalten der fluoreszenzmarkierten Proteine nach der Fusion wurde miteinander verglichen. Es zeigte sich, dass Viren mit dem MLV-Hüllprotein effizient an der Plasmamembran fusionierten. Außerdem blieb das fluoreszenzmarkierte Matrix-Protein, von dem bislang angenommen wurde, dass es sich nach der Fusion schnell im Zytosol auflöst, über längere Zeit als punktierte Struktur sichtbar. In unserem experimentellen System kann die Trennung der Matrix vom Viruskern auch erst Minuten nach der Fusion erfolgen.

Translation of abstract (English)

In the last decades HIV-1 has been the subject of intense research. However, the early steps of the viral cell entry are not yet fully understood. Established biochemical and virological methods are able to address viral fusion and subsequent steps of viral infection only at the costs of time resolution and by using methods that artificially synchronise the cell cycle. Here, we study the viral fusion on a single particle level using live cell imaging. For this purpose a fusion indicator was developed relying on the fluorescent signals of single particles. An additional fluorescent label within the viral membrane was introduced into a previously fluorescently labelled HIV particles. When fusion occurs, this membrane label remains at the cellular membrane and is thereby separated from the first fluorescent particle marker. Pseudotyping of HIV particles with the MLV.Env.YFP turned out to be an efficient way to label the viral membrane. Compared to HIV.Env, the MLV.Env is highly fusogenic thereby increasing the probability to detect single fusion events. To further enhance the detection probability a new assay protocol was established. The chosen procedure allowed the quantification of virus-cell interactions. After detailed assay characterisation more than 20.000 single particle tracks were analysed using an automated virus tracking algorithm. Based on fluorescent signal separation 28 fusion events were identified. For a further characterisation of the early steps of viral infection the inner particle structure was visualised with different fluorescently tagged HIV proteins. The behaviour of the different viral markers after fusion was compared against each other. It turned out that MLV.Env particles fused at the plasma membrane efficiently. In addition, the fluorescently tagged viral Matrix protein remained visible as a punctuated structure beyond the moment of fusion. Currently it is believed that the MA proteins dilutes in the cytosol during or briefly after the fusion. We could show that the separation of MA from the particle core can be delayed for several minutes in our experimental setup.