German Title: Gen-Immuntherapy mit TRAIL und dem bispezifischen Antikörper EpCAMxCD3 für die selektive Induktion von Apoptose im fortgeschrittenen Prostata und Pankreaskarzinom

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Abstract

The aim of this project was to test the efficacy of a novel therapeutic approach for cancer therapy. This approach combines immunotherapy with bispecific antibody (bsAb)EpCAMxCD3 and gene therapy with TRAIL. The potential efficacy of this approach was tested in experimental models of pancreatic and prostate carcinoma. Specific aims were i) to construct a lentiviral vector suitable for the transduction of human lymphocytes and the over-expression of TRAIL. The next aim was ii) to establish and to evaluate suitable xenograft models for the study of the chosen approach, iii) to test the efficacy and the anti-tumor potential of TRAIL-over-expressing lymphocytes and bsAb EpCAMxCD3 in vivo and iv) to elucidate the functional mechanisms underlying observed anti-tumor effects of TRAIL-over-expressing lymphocytes and bsAb EpCAMxCD3 in vivo and in vitro. In conclusion, this is the first study, which shows the effective lentiviral transduction of human lymphocytes with the death ligand TRAIL. The vector pV3TP2A effectively transduced human lymphocytes to over-express TRAIL. The majority of these TRAIL-over-expressing lymphocytes were CD8+ T cells and retained their cytotoxic functions, their migratory and proliferative properties after the transduction. Furthermore, this study showed that EpCAMxCD3 possesses a potent anti-tumor activity in vivo. In NOD/SCID mice, EpCAMxCD3 had a long serum half-life (t1/2 ∼ 7 days). In two mouse models the combination of EpCAMxCD3 with lymphocytes significantly retarded the growth of BxPc-3 pancreatic and PC-3 prostate cancer xenografts. For mimicking a pancreatic cancer microenvironment in vitro a 3D tumor reconstruct system was used, in which lymphocytes were co-cultured with EpCAM-expressing tumor cells and fibroblasts in a collagen matrix. In this in vivo-like system EpCAMxCD3 potently stimulated the production of the effector cytokines IFN-γ and TNF-α by extracorporally pre-activated lymphocytes. Moreover, compared with a bivalent anti-CD3 antibody, EpCAMxCD3 more efficiently activated production of TNF-α and IFN-γ by non-stimulated PBMCs. We demonstrate for the first time that EpCAMxCD3 induces prolonged contacts between lymphocytes and tumor cells, which may be one of the main reason for the observed anti-tumor effects. The combination with lymphocytes over-expressing the death ligand TRAIL could effectively enhance the anti-tumor effects of bsAb EpCAMxCD3. The combination with TRAIL-over-expressing lymphocytes enabled us to strongly reduce the dose of EpCAMxCD3 necessary for an anti-tumor effect. This is a great advantage, which could minimize potential side effects of bsAb treatment. EpCAMxCD3 did not alter lymphocyte migration as measured by time-lapse video microscopy, which is an important prerequisite for future use in patients. Apoptosis induction in tumor cells by TRAIL-over-expressing lymphocytes was confirmed in vitro in 3D tumor reconstructs. In cytotoxic killing assays, the anti-tumor effect of TRAIL-over-expressing lymphocytes was significantly enhanced by EpCAMxCD3. In 3D gels, lymphocytes were effective producers of IFN-γ, TNF-α and chemokines, which could also be detected in vivo from tumor lysates. An increased infiltration of the tumor islets with macrophages and granulocytes was observed upon treatment with TRAIL-over-expressing lymphocytes and EpCAMxCD3. A potential explanation for the demonstrated anti-tumor effect of EpCAMxCD3 and TRAIL-over-expressing lymphocytes combination therapy, is an enhancement of the observed effects of single treatment, namely the reduced proliferation in tumor cells, decreased blood vessels formation, local production of cytokines and chemokines, apoptosis and an increased infiltration of tumor tissue with macrophages. Conclusively, the combination of TRAIL-over-expressing lymphocytes and the bispecific antibody EpCAMxCD3 was very efficient in pancreatic and prostate xenograft models in vivo. This combination of gene therapy with immunotherapy could potentially be a possible therapeutic option for the clinical application in the future.

Translation of abstract (German)

Ziel dieser Studie war einen neuartigen Therapieansatz für die Krebstherapie zu testen. Dieser Ansatz kombiniert die Immuntherapie mit dem bispezifischem Antikörper (bsAk) EpCAMxCD3 mit einer Gentherapie mit TRAIL. Die potentielle Wirksamkeit dieser Therapie wurde in experimentellen Modellen des Prostata und des Pankreaskarzinoms getestet. Konkrete Ziele dabei waren i) die Generierung eines lentiviralen Vektors, der geeignet für die Transduktion von humanen Lymphozyten ist und die Überexpression des Todesliganden TRAIL ermöglicht, ii) die Etablierung und die Evaluierung eines geeigneten Xenograft Models, iii) die Untersuchung der Effektivität und der Anti-Tumor Wirkung TRAIL- überexprimierender Lymphozyten mit bsAk EpCAMxCD3 in vivo und in vitro und iv) die Analyse des Funktionsmechanismus der beobachteten Anti-Tumor Wirkung von TRAIL-überexprimierender Lymphozyten und EpCAMxCD3 in vivo und in vitro. Zusammenfassend zeigte diese Studie dass EpCAMxCD3 eine potente Anti-Tumor-Wirkung in vivo besitzt. In NOD/SCID Mäusen besaß EpCAMxCD3 eine lange Serum Halbwertszeit von ungefähr 7 Tagen. In zwei unabhängigen Mausmodellen reduzierte EpCAMxCD3 zusammen mit Lymphozyten effizient das Tumorwachstum von pankreatischen BxPc-3 und Prostata PC-3 Xenografts. Um die Mikroumgebung eines Karzinoms in vitro nachzuahmen, wurde ein 3D Tumor Rekonstrukt benutzt in dem Lymphozyten zusammen mit EpCAM- exprimierenden Tumorzellen in Fibroblasten in einer Kollagenmatrix co-kultiviert wurden. In diesem in vivo artigem System stimulierte EpCAMxCD3 die Produktion der Effektorzytokine IFN-γ und TNF-α in voraktivierten Lymphozyten. Verglichen mit bivalenten anti-CD3 Antikörpern, stimulierte EpCAMxCD3 sogar die Produktion von IFN-γ und TNF-α von unstimulierten Lymphozyten. Wir demonstrieren hier erstmalig dass EpCAMxCD3 die Kontaktzeit zwischen Lymphozyten und Tumorzellen verlängert, was die Grundlage für die Anti-Tumor Wirkung sein könnte. Als eine wichtige Vorraussetzung für eine mögliche klinische Anwendung hatte EpCAMxCD3 keinen Einfluß auf die Migration von Lymphozyten, was mit Time-lapse Video Mikroskopie demonstriert wurde. Die Kombination mit Lymphozyten die den Todesliganden TRAIL überexprimierten verstärkte die Anti- Tumor-Wirkung von EpCAMxCD3 sehr effizient. Schon geringe Dosen von EpCAMxCD3 genügten um eine Anti-Tumor Wirkung zu erzielen in dieser Kombination mit TRAIL- überexprimierenden Lymphozyten. Diese Tatsache könnte vorteilhaft sein um mögliche Nebeneffekte der Behandlung zu minimieren. Die Induktion von Apoptose in Tumorzellen konnte in 3D Tumor Rekonstrukten in vitro gezeigt werden. In Versuchen zur Zytotoxizität von Lymphozyten auf Tumorzellen wurde die Wirkung von TRAIL-überexprimieren Lymphozyten noch durch EpCAMxCD3 signifikant gesteigert. In 3D Tumor Rekonstrukten wurden neben den Zytokinen IFN-γ und TNF-α auch Chemokine produziert, die sowohl in vitro als auch in Tumor Lysaten detektiert werden konnten. Diese Chemokine stehen höchstwahrscheinlich im Zusammenhang mit der vermehrten Infiltrierung des Tumorgewebes mit Makrophagen und Granulozyten nach der Behandlung mit TRAIL-überexprimierenden Lymphozyten und mit EpCAMxCD3. Eine mögliche Erklärung für die gezeigte Anti-Tumor Wirkung von TRAIL-überexprimierenden Lymphozyten und EpCAMxCD3 ist eine Reduktion der Blutgefäße, die lokale Produktion von Zytokinen und Chemokinen mit einer vermehrten Einwanderung von Makrophagen in das Tumor Gewebe. Zusammenfassend konnte die Kombination aus TRAIL-überexprimierenden Lymphozyten und dem bispezifischen Antikörper EpCAMxCD3 erfolgreich für die Therapie experimenteller Pankreas und Prostata Tumor Xenografts in vivo getestet werden.