English Title: Mobility of eGFP-oligomers in living cell nuclei

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Abstract

Bewegungen von Partikeln in Zellkernen können durch die Viskosität, aktiven Transport oder die Anwesenheit von Hindernissen, wie zum Beispiel dem Chromatinnetzwerk, beeinflusst werden. In dieser Arbeit wurde untersucht, ob die Mobilität von kleinen Proteinen einer Größe zwischen 27 und 108 kDa von der Chromatindichte beeinflusst wird. Die Diffusion von inerten fluoreszierenden Proteinen wurde in Zellkernen von lebenden Zellen mit Fluoreszenzkorrelationsspektroskopie (FCS) an einem zwei-Farben-Detektions-system untersucht. Zunächst werden der Neuaufbau und die Optimierung des Messsystems, sowie die Entwicklung einer neuen, patentierten Messkammer für mikroskopische Beobachtungen und Messungen (CHAMO) beschrieben. Im Anschluss werden Experimente vorgestellt, die FCS-spezifische Artefakte in lebenden Zellen untersuchen, sowie Strategien, um diese zu vermeiden. Insbesondere werden Artefakte besprochen, die aus der Auswahl der Fluorophore zur Kalibrierung des Fokusvolumens sowie aus der Temperatur und der Aufnahmebedingungen bei den Messungen der Fluoreszenzfluktuationen resultieren. Nachdem die optimalen Aufnahmebedingungen definiert wurden, zeigen die Ergebnisse der Experimente, dass die Mobilität von eGFP in Zellkernen lebender Zellen signifikant variiert, aber nicht mit der Chromatindichte korreliert. Die intranukleare diffusive Mobilität hängt stark von der Proteingröße ab: in einer Serie von eGFP-Oligomeren, die als inerte Sonde verwendet wurden, nimmt der Diffusionskoeffizient vom Monomer zum Tetramer viel stärker ab als für freie Moleküle in wässriger Lösung. Dennoch bleibt das gesamte intranukleare Chromatinnetzwerk für kleine Proteine bis zu einer Größe von dem eGFP-Tetramer frei erreichbar, ungeachtet der Chromatindichte oder der Zelllinie. Diffusionsmessungen in freier Lösung deuten auf eine stäbchenförmige Struktur für die eGFP-Oligomere. Diese Annahme beruht auf den gemessenen Diffusionskoeffizienten und theoretischen Rechnungen für die Diffusion zweier möglicher Geometriemodelle. Schließlich werden erstmalig Karten der Diffusion von Proteinen in Nuklei lebender Zellen, sowie von gesamten lebenden Zellen vorgestellt. Diese Kartierung unterstützt die Ergebnisse der Einzelpunktmessungen: die diffusive Mobilität von kleinen eGFP Proteinen zeigt starke Variationen in einem gegebenen Zellkern, jedoch ohne Korrelation zur Chromatindichte.

Translation of abstract (English)

Mobility of particles in cell nuclei can be affected by viscosity, active transport, or the presence of obstacles such as the chromatin network. In this work, I investigated whether the mobility of small fluorescent proteins in a size range between 27 and 108 kDa is affected by the local chromatin density. Diffusion of inert fluorescent proteins was studied in living cell nuclei using fluorescence correlation spectroscopy (FCS) on a two-color confocal scanning detection system. Initially rebuilding and optimization of the measurement system were required to achieve optimal measuremt conditions. Additionally I developed a new, patented, measurement chamber for microscopy observations and measurements (CHAMO). Furthermore, experiments were conducted which elucidated FCS-specific artifacts encountered during live cell studies, as well as strategies to prevent such artifacts. In particular I addressed those artifacts that arise from the choice of the fluorophore used during focal volume calibration, as well as temperature and acquisition conditions used for fluorescence fluctuation measurements. I have shown, using the newly optimized conditions, for various human cell lines, that the mobility of GFP varies significantly within the cell nucleus, but does not correlate with local chromatin density. The intranuclear diffusional mobility strongly depends on protein size: In a series of GFP-oligomers used as free inert fluorescent tracers, the diffusion coefficient decreased from the monomer to the tetramer greater than that expected for molecules freely diffusing in aqueous solution. interstingly, the entire intranuclear chromatin network is freely accessible to small proteins, up to the size of eGFP-tetramers (108 kDa), regardless of the chromatin density or cell line. Notably, even the most dense chromatin regions do not exclude free eGFP-monomers or multimers. A rod shaped structure was proposed for the eGFP oligomers, which is based upon measured diffusion coefficients in acqueous solution and theoretical calculations for the diffusion of two possible geometrical models. This is the first study to show protein diffusion maps in living cell nuclei as well as in whole living cells. This mapping supports the results taken from single point measurements, where the diffusive mobility of small eGFP proteins show strong variations in a particular cell nucleus, however always with no correlation to the local chromatin density.